1.2 非生物抗性方面
1996年日本有关报告指出,把来自大肠杆菌的谷胱甘肽还原酶基因导入杂种杨,已培育出抗活性氧的转化体。1998年arisi等将拟南芥的fe-sod基因导入杨树,增加了转基因杨树的习化能力和耐冻性。另外,法国inra的lise jouanin实验室已将查尔酮合成酶(chs)基因导入杨树,降低了转基因植株对低温的敏感性。
2 国内杨树抗性基因工程研究现状
杨树基因工程育种是林木基因工程研究领域的一个重要部分,它可在体外定向进行基因重组和基因改造,通过相应的载体实现基因转移。我国利用基因工程技术进行杨树抗性遗传改良起步虽晚,但进步较快,取得了一些可喜成绩。
2.1 生物抗性方面
2.1.1 抗虫
我国已成功地将抗鳞翅目昆虫的bt毒蛋白用根癌农杆菌导入欧洲黑杨,并获得转基因植株,这使我国在该领域的研究达到了国际先进水平。
中国林科院(1993~1997)成功地将苏云金杆菌bt杀虫蛋白基因导入欧洲黑杨、欧美杨和美洲黑杨,获得对舞毒蛾有毒杀作用的杨树转基因植株,并进入田间试验。郑均宝等(1995)用含有完全改造的bt抗虫基因表达载体pb48.7和部分改造的bt抗虫基因表达载体pb48.6转雄性毛白杨,获得了转基因植株。中国科学院微生物所和中国林科院用不同长度的bt基因转化欧洲黑杨获得成功;中科院上海植生所和南京林业大学合作将bt基因和马铃薯的胰蛋白酶抑制基因导入毛白杨和美洲黑杨×小叶杨无性系nl80106,得到了一批转基因植株,目前正在进行分子检测。1996年中国林科院和北京大学合作开展了抗菌肽lci基因转化杨树的研究,试图培育出一批抗蛀干害虫天牛的转基因植株。
另外,郝贵霞等(1999)已成功将广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)导入毛白杨,并获得转基因植株,现已进入大田检测。
2.1.2 抗病
1999年赵世民等将兔防御素np-1基因导入毛白杨,结果发现转基因植株组织提取液对枯草杆菌、农杆菌和立枯病原菌等多种微生物的生长均有不同程度的抑制作用。
2.2 非生物抗性方面山东农业大学温尚昆等(1997)由根癌农杆菌介导毛白杨导入与抗旱有关的激素合成基因建立转化系统,获得再生植株。1994年我国已获得耐盐转基因杨树。1999年白根本利用mrna差异显示法从胡杨中克隆到几个耐盐基因片段,现已开始进一步筛选和转化杨树的研究。另外,通过转化山菠菜碱脱氢酶(badh)、磷酸山梨醇脱氢酶(gutd)基因获得耐盐杨树的研究目前也正在进行之中;同时,南京林业大学还与日本合作开展了抗二氧化硫和臭氧污染的转基因杨树研究。北京林业大学毛白杨研究所现已从耐极端低温(-20℃)的甜杨中诱导出与抗冻性相关的特异蛋白,正着手分离克隆其相关抗冻基因。
3 杨树抗性基因工程研究中存在问题
杨树抗性基因工程研究虽然取得了一些突破性进展,但同农作物相比,仍然还处在一个初级阶段,还存在着许多问题有待于去研究解决。
3.1 抗性基因工程研究存在局限性
杨树抗性基因工程研究目前仅局限于抗除草剂、抗病和抗食叶害虫等生物抗性,例如bt基因植株仅能对鳞翅目的少数虫种产生杀虫效果,各种胰蛋白酶抑制剂基因表达量不够理想。因此,利用转抗性范围广的双价抗性基因(甚至多价抗性基因)的累加效应是克服上述这些问题的希望所在。同抗病虫基因工程相比,杨树抗寒冻、抗旱及抗盐碱等抗逆基因工程的研究相对薄弱,至今未见成功报道。
3.2 有利于杨树抗性遗传改良的外源基因来源贫乏
目前能有效地利用在林木基因工程中的基因寥寥无几,而这些基因又都是从农作物上引用来的,许多有用的抗性基因还不能识别和分离出来被利用。已成功地向杨树导入的为数不多的抗病虫及抗除草剂基因大都是来源于细菌(或放线菌)的控制单一性状的简单基因,而杨树需要赋予的性状(如抗寒冻、抗旱及抗盐碱等)大都是多基因控制的,仅靠细菌等少数生物材料提供基因很显然是难以满足的。因此,要根据林木自身的特点研究发掘适合于杨树抗性提高的主基因,这是解决杨树抗性育种的关键。
3.3 抗性基因构建、转化及检测技术需要进一步研究开发
杨树基因组结构存在某些特殊的地方如重复序列多、不易提纯等,使杨树转基因植株的分子生物学检测相对比较困难。目前常用的天然载体一根癌农杆菌ti质粒虽然能转化杨树,但转化率还很低,即便是已获得了转化细胞,分化再生成植株的过程中还存在着许多困难,这些因素在一定程度上延缓了杨树抗性基因工程研究的进展。因此进行目的基因构建,寻找更有效的基因载体,进一步完善转化技术和加强分子生物学研究,是提高杨树抗性基因工程成功率的重要方面。